WB实验总结｜显影条带异常分析&解决思路

7/9/2024 4:10:00 PM

问题一：

条带呈现波浪状，形似“八爪鱼”，丑丑不好看？

图1：改善前

图2：改善后

问题分析：

胶没凝固好或者制胶体系有问题？电流电压不稳？

问题解决：

回顾实验，制胶采用制胶试剂盒严格按照说明书比例进行配制，故而延长了凝胶时间，重新实验后仍未改善，由此怀疑电流电压不稳。

实验室电泳液的配制为：TRIS（3.02g）+ 甘氨酸（14.42g）+SDS（1g）+ 纯水（1L），怀疑是称量不准导致，换用成品的电泳缓冲液粉后条带立马变直（注：成品电泳缓冲液粉虽比较贵，但重复使用两三次是没有问题的）。

问题二：

目的带背景深

图1:20ug蛋白上样量与30ug蛋白上样量对比图

图2：20ug蛋白量，洗膜5次，且加大PBST用量后

图3：30ug蛋白量，洗膜5次，且加大PBST用量后

问题分析：

蛋白上样量大？洗膜不充分？封闭液（脱脂牛奶）浓度低，时间短？

问题解决：

对比图可知，蛋白上样量大确实会产生较深的背景，最终以：

最后成功实现显影条带降背景。

问题三：

隐约可见的目的带甚至无目的带？

图1：换用新配制二抗，无目的带出现

图2：重新配制二抗，仍无目的带（未换离心管）

问题分析：

蛋白表达低？抗体浓度太低或孵育时间太短？转膜失败？或许是二抗出现问题！

问题解决：

同一个蛋白，同样的抗体孵育条件，唯一不同的是换用了新配制的二抗，二抗的稀释比例及孵育条件均未改变，重新配制二抗后仍无条带出现。

忽然注意到一个小细节，就是因为两次配制二抗间隔时间不久，所以未换用新的离心管，有可能是其引起。

换用新的离心管重新配制后，目的带出现，由此可见任何可能被忽略的小细节均有可能导致实验的失败哦！

问题四：

显影出现黑斑，或者出现细沙样均匀的黑颗粒样物质，呈现磨砂玻璃样

问题分析：

转膜时转膜液中有未溶解的颗粒状物附着在了膜上？封闭时脱脂牛奶未溶解完全？二抗有问题？

问题解决：

转膜液配制时采用磁力搅拌器使其充分溶解，多次实验发现不均匀的黑斑多是脱脂牛奶未溶解完全导致。

所以脱脂牛奶的配制要十分小心，每次配完脱脂牛奶后先在涡旋振荡器上振荡混匀几分钟，然后放置与摇床上使其充分溶解。

小tip：脱脂牛奶的配制不宜太早或太迟，太早配制可能会引起变质，太迟配制影响其溶解，可在电泳开始后进行配制，配制完成后可短暂放于4℃冰箱保存。

而均匀的细小黑斑通常由二抗使用次数过多，长期未更换引起，更换二抗即可恢复正常。

本文作者是"夏沫梦鸢"同学，这篇文章是他精心汇总的关于Western blot最后一部显影操作中出现的4种条带异常的现象及解决方案。在获得他的授权后，实验老司机将本文发表于公众号。

文稿：夏沫梦鸢

校对：樊振华

素材：Canva

参考资料：