Gene Tools I Morpholino的基因敲降原理简析

12/13/2023 11:32:00 AM

Morpholino是什么？

Morpholino（MO）全称Morpholino Anti-sense oligos，是由美国Gene Tools公司研发的第三代反义寡核苷酸，应用范围广泛：

01 基因功能体内/体外研究

02 富含核酸酶环境下的 RNAi 实验

03 药物靶标体内鉴定和确认

04 RNAi 治疗药物开发

MO属于DNA/RNA类似物，相比核酸分子，MO分子结构特殊之处在于用吗啉环取代了传统核苷酸上的五碳糖环，原有的磷酸基团也发生改变，使得分子整体不带有任何电荷，因此Morpholino不能被RNase和DNase识别，不需要担心被降解，稳定性远高于siRNA。

MO一般包含25个碱基，也是基于反义技术与目标mRNA结合。通过与不同阶段的mRNA结合，阻断目标基因的表达，包括mRNA剪切阶段和翻译阶段。

Morpholino的体内应用

动物体内生理环境非常复杂，传统的siRNA 易被核酶降解，难以在体内持续发挥作用，因此要想将siRNA 应用于动物活体实验，必须要考虑其在体内的稳定性、半衰期、靶向性、纯度、药活性以及毒性等因素，通常需要通过特殊的化学修饰才能实现。

一般的MO必须要通过转染或注射等方法才能进入细胞，这难免会影响细胞的活性和状态，也限制了MO在组织基因特性和基因敲减方面的应用。除了一般的MO外，还有vivo-MO，后者在普通MO的3’端连接了亲和反应基团，可以不借助转染试剂直接进入细胞内，因此vivo-MO可直接应用于体外组织器官培养和活体动物实验，而不需要其他递送辅助手段。

MO两种调控基因表达下调的方式

01 翻译阻断MO

阻断方式：空间位阻

结合对象：成熟mRNA

机理：阻断核糖体前体（Initiation Complex）的组装

阻断的靶区域：AUG（起始密码子）开始的25个碱基以及5’UTR

特异性高：低于5个错配碱基

翻译阻断MO的作用机理是通过阻止核糖体起始复合物的组装，从源头上抑制翻译过程，达到基因敲降效果。核糖体是细胞内一种核糖核蛋白颗粒（ribonucleoprotein particle），主要由rRNA和蛋白质构成，主要功能是合成蛋白质多肽链。核糖体的结构包括大亚基和小亚基，正常的翻译过程需要大亚基和小亚基组装成完整的核糖体，结合RNA和起始因子，形成翻译起始复合物。

翻译起始复合物沿mRNA向下移动至ATG翻译起始密码子，翻译过程正式开始。在这一段移动距离内结合的MO通常会阻止翻译起始复合物的移动，从而阻止翻译。通常翻译阻断MO的结合位点选择在成熟mRNA的起始密码子附近，譬如ATG及其后的22个核苷酸，或者包含ATG在内的上下游共25nt的序列都可以达到抑制核糖体移动的目的。

02 剪切阻断MO

阻断方式：空间位阻

结合对象：Pre-mRNA

机理：干扰Pre-mRNA的剪切，导致生成的mRNA缺失目标外显子

阻断的靶区域：Pre-mRNA的“外显子+内含子”交界处

特异性高：低于5个错配碱基

剪接阻断MO的作用机理是通过空间位阻作用阻止前体mRNA（Pre-mRNA）的剪接，干扰蛋白质的合成。

正常生理状态下，Pre-mRNA借助剪接体完成剪接，包括组成型剪接和可变剪接，分别产生一种或者多种转录本，其中可变剪接与疾病密切相关，有重要的研究价值。Pre-mRNA上有保守的剪接相关序列有助于剪接体的识别并结合，而这些序列主要存在于内含子上。剪接体组装的基石是5种富含尿嘧啶的小核核糖核酸-蛋白质复合物（U1，U2，U4/ U6和U5 snRNP）。

snRNP的正确组装是RNA剪接复合体形成的必要前提。剪接阻断MO结合至剪接位点和内含子在剪接点附近的内含子中的小核RNA（snRNP）结合位点，MO引起剪接体的空间位阻，使得不能利用靶向的剪接位点并且为了有利于下一个上游可用剪接位点而被跳过。这通常会导致目标外显子与侧翼内含子一起被切除。

Morpholino产品优势

（1）不被核酸酶识别，对比传统siRNA稳定性极强

（2）精确序列设计，提高对靶RNA特异性

（3）适用于多种生物研究模型

（4）SCI引用文献已达10510篇截至发稿为止

（5）免费设计morpholino序列

（6）无毒副作用

（7）粉末状，常温运输，有效期

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